密度梯度離心技術(shù)分離穩(wěn)定同位素的方法
導讀:有別于傳統(tǒng)的通過富集分離純化技術(shù)獲得一些純培養(yǎng)污染物降解功能微生物，穩(wěn)定同位素技術(shù)（SIP-DNA）可以更加便捷的鑒定出功能基因。本研究上海安亭科學儀器廠針對 SIP-DNA 中密度梯
來源：未知
發(fā)布日期：2020-01-09 11:45【大 中 小】
據(jù)上海安亭科學儀器廠了解到超速離心機是分子生物實驗室最常用的科研儀器之一，能將具有不同沉降系數(shù)、質(zhì)量和密度的混合物在離心機高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力場作用下進行快速分離、濃縮和純化。密度梯度區(qū)帶離心法(簡稱區(qū)帶離心法)，是超速離心機常用的一種離心方法，在一定的離心力下將加入惰性梯度介質(zhì)的樣品進行離心沉降，把所需的顆粒分配到梯度中某些特定位置，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法能夠在保持顆?；钚詶l件下很好地將不同顆粒的物質(zhì)進行分離。上海安亭科學儀器廠為探究環(huán)境中降解某種污染物功能微生物，傳統(tǒng)的方法是通過加大富集培養(yǎng)和分離的方式獲得。然而，并非所有微生物都可以獲得純培養(yǎng)，而且實驗室條件下獲得可培養(yǎng)的土壤微生物受到很多因素的限制。所以通過傳統(tǒng)方式獲得的某種污染物的功能降解菌可能無法準確反映污染環(huán)境中微生物分布的真實情況，也不能預測功能微生物對底物的同化代謝水平。
本研究上海安亭科學儀器廠就從這些問題出發(fā)，采用密度梯度離心法中的等密度區(qū)帶離心法，以貝克曼公司的OptimaXPN-100超速離心機，VTI-90垂直轉(zhuǎn)頭為例，用氯化銫為介質(zhì)，構(gòu)建了超速離心機分離SIP-DNA樣品的條件、相關(guān)參數(shù)，以及如何根據(jù)離心后樣品的指標判定樣品是否有效分離。目前該技術(shù)在國內(nèi)只有少數(shù)幾個團隊使用，掌握該技術(shù)，可以為高校科研和教學提供強有力的技術(shù)手段，而且大大提高昂貴的超速離心機的使用價值。
FastDNA快速提取試劑盒（MoBioLaboratories,SolanaBeach,CA），CsCl（AR99%，成都西亞試劑），Tris-EDTA（TE，pH8.0）。OptimaXPN-100超速離心機，貝克曼垂直轉(zhuǎn)子VTI-90（最高轉(zhuǎn)速(rpm)90000，最大相對離心力(×g)645000，最大容量(ml)8×5.1），ND-1000UV-vis紫外可見分光光度計（NanoDropTechnologies，Wilmington，DE），AR200數(shù)顯手持式折光儀（LeicaMicrosystemsInc.）。
密度梯度離心技術(shù)是實現(xiàn)SIP-DNA樣品分離的關(guān)鍵技術(shù)，本研究上海安亭科學儀器廠通過實驗獲得了超速離心機分離SIP-DNA樣品的最佳條件（以CsCl為惰性介質(zhì)，在20℃，45000g離心48小時，離心后分為14層）。根據(jù)每層的浮力密度和DNA濃度這兩個參數(shù)可以判定分離是否成功，成功分離后的重的同位素樣品與正常樣品相比不僅相同層數(shù)浮力密度大，在相同浮力密度層DNA濃度最大位置也會比較靠后。該技術(shù)可為后續(xù)16SrRNA高通量測序提供前提和保障。根據(jù)高通量數(shù)據(jù)結(jié)果可以從整體水平上反應環(huán)境樣品微生物群落水平，也可以更準確的認識自然條件下微生物的作用與具體的功能微生物。
以上內(nèi)容僅供參考。
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